目前SARS-CoV-2臨床試驗(yàn)用脂質(zhì)納米顆粒的開(kāi)發(fā)

mRNA最早的轉(zhuǎn)染試劑是季銨化陽(yáng)離子DOTAP結(jié)合可電離和融合的DOPE，采用DNA轉(zhuǎn)染[85]，用于在眾多細(xì)胞類(lèi)型中轉(zhuǎn)染mRNA[86]。盡管在體外有效，但永久性陽(yáng)離子季銨基團(tuán)使這些大尺寸的脂復(fù)合物從循環(huán)和其通常靶器官肺中迅速清除，并表現(xiàn)出毒性。今天LNP的先驅(qū)是穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒(SPLP)，它是由融合基因電離的DOPE與季銨化的陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAC結(jié)合形成的，DODAC靜電結(jié)合并包裹質(zhì)粒DNA，然后用親水性PEG包被，使其在水介質(zhì)中穩(wěn)定，并在體內(nèi)給藥時(shí)限制蛋白質(zhì)和細(xì)胞相互作用[87]。DOPE在細(xì)胞攝取后可在內(nèi)涵體中質(zhì)子化，由于呈錐形，因此可與內(nèi)涵體磷脂形成內(nèi)體溶解離子對(duì)，以促進(jìn)內(nèi)涵體釋放，這是成功遞送的關(guān)鍵事件[17]。然后進(jìn)一步將SPLP開(kāi)發(fā)為含有siRNA的穩(wěn)定核酸脂質(zhì)顆粒(SNALP)，包括四種脂質(zhì)：離子化而不是季銨化陽(yáng)離子脂質(zhì)、飽和雙層形成季銨化兩性離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)[88]。除了與核酸靜電結(jié)合外，SNALPs中的可電離脂質(zhì)發(fā)揮了融合脂質(zhì)的作用，并在內(nèi)涵體中質(zhì)子化，與內(nèi)涵體磷脂形成膜不穩(wěn)定離子對(duì)。目前已知DSPC有助于在PEG表面下形成穩(wěn)定的雙層[89]。膽固醇發(fā)揮多種作用，包括填補(bǔ)顆粒間隙、限制LNP–蛋白質(zhì)相互作用和可能促進(jìn)膜融合[90]?？呻婋x脂質(zhì)在生理pH下呈中性，從而消除循環(huán)中的任何陽(yáng)離子電荷，但在pH~6.5的內(nèi)體中質(zhì)子化，促進(jìn)內(nèi)體釋放，發(fā)揮核心作用。

2018年臨床批準(zhǔn)的首個(gè)siRNA產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)主要集中在優(yōu)化可電離脂質(zhì)，其次是PEG脂質(zhì)和LNP中使用的四種脂質(zhì)的比例，以及LNP組裝和生產(chǎn)程序。根據(jù)分子形狀假設(shè)[12,91]，發(fā)現(xiàn)C18尾中不飽和鍵的最佳數(shù)量是通過(guò)醚連接到二甲胺頭基的二亞油酸尾[88]。然而，在亞油酸尾部引入單個(gè)連接體，其具有從二甲胺頭基到連接體的優(yōu)化碳數(shù)，導(dǎo)致LNP中可電離脂質(zhì)DLin-MC3-DMA的pKa接近6.4[92,93]。優(yōu)化的最后一步是將MC3/DSPC/膽固醇/PEG–脂質(zhì)的這些脂質(zhì)摩爾比調(diào)節(jié)至50/10/38.5/1.5。總體從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的這一優(yōu)化過(guò)程需要在數(shù)千種制劑中篩選超過(guò)300種可電離的脂質(zhì)，并導(dǎo)致效價(jià)增加200倍和有效劑量相應(yīng)減少，以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因> 80%的持久抑制和允許治療窗，2018年Onpattro™獲得臨床批準(zhǔn)[94,95]。這種為siRNA開(kāi)發(fā)的MC3配方是隨后開(kāi)發(fā)LNPs的基礎(chǔ)，如下所述（圖1），在被批準(zhǔn)用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的遞送后，LNPs現(xiàn)在正被緊急使用。

圖1 mRNA脂質(zhì)納米顆粒結(jié)構(gòu)。最近使用冷凍電子顯微鏡[96]、小角中子散射和小角X射線散射[89]進(jìn)行的研究表明，mRNA脂質(zhì)納米顆粒包括低拷貝數(shù)的mRNA(1-10)，并且mRNA與占據(jù)LNP中心核心的可電離脂質(zhì)結(jié)合。聚乙二醇(PEG)脂質(zhì)形成脂質(zhì)納米顆粒(LNP)的表面，同時(shí)形成雙層的DSPC。帶電荷和不帶電荷的膽固醇和可電離脂質(zhì)可分布在整個(gè)LNP中。其他輸送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖在最近的綜述中提供[14]。

Moderna使用上述Onpattro制劑中的MC3進(jìn)行了幾項(xiàng)臨床前[97,98,99]和臨床研究[97,100]，以遞送核苷修飾的mRNA編碼免疫原。在這些比較新的一類(lèi)可電離脂質(zhì)與MC3的研究中，MC3后來(lái)被確定為可電離脂質(zhì)[42,101]。這個(gè)新類(lèi)別包括Lipid H[42]，它是Moderna的SARS-CoV-2產(chǎn)品mRNA-1273中的可電離脂質(zhì)SM-102[41]（表2）。

使用針對(duì)寨卡病毒的核苷修飾的mRNA編碼免疫原，MC3 LNP能夠保護(hù)缺乏I型和II型干擾素(IFN)信號(hào)的免疫功能低下小鼠免受10µg劑量1次或2µg劑量初免-加強(qiáng)免疫設(shè)計(jì)的致死攻擊[99]。在預(yù)先給予抗ifnar1阻斷抗體以建立致死模型的免疫功能正常小鼠中也獲得了相似的結(jié)果。在一系列遞送核苷修飾的mRNA編碼血凝素(HA)免疫原的流感研究中，皮內(nèi)遞送的MC3 LNP能夠完全保護(hù)小鼠免受低至0.4µg單次給藥的致死性攻擊，盡管即使單次給予高達(dá)10µg劑量，攻毒后也會(huì)出現(xiàn)體重減輕[97]。雪貂單次給予50µg或100µg劑量產(chǎn)生了較高的HAI（血凝抑制試驗(yàn)）滴度，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物單次給予200或400µg劑量也產(chǎn)生了較高的HAI滴度。在接受100µg劑量的少數(shù)(23)人類(lèi)受試者中，在研究開(kāi)始時(shí)，所有受試者的HAI滴度均 > 40（who保護(hù)相關(guān)性），比基線高4倍以上。在一項(xiàng)更大規(guī)模的1期試驗(yàn)中，使用相同的MC3 LNPs遞送兩種不同的核苷修飾的mRNA編碼的HA免疫原，肌肉注射100µg的H10N8免疫原導(dǎo)致23名受試者中100%的HAI滴度 > 40[100]。盡管未發(fā)生危及生命的不良事件，但這23例受試者中有3例發(fā)生了重度3級(jí)不良事件。3例受試者中的2例發(fā)生3級(jí)不良事件（符合研究暫停規(guī)則）后，停止計(jì)劃的400µg給藥。在較低劑量下，不良事件的頻率和嚴(yán)重程度降低，但幾乎每例受試者均發(fā)生至少1起不良事件。這些研究很有前景，但也強(qiáng)調(diào)了在不會(huì)引起問(wèn)題數(shù)量的不良事件的劑量下獲得保護(hù)性免疫的治療窗相對(duì)較窄。這讓人想起MC3前體DLin-DMA的治療窗窄，需要提高效力才能降低劑量，仍然實(shí)現(xiàn)有效的基因敲低。

表2脂質(zhì)納米顆粒中使用的可電離脂質(zhì)。脂質(zhì)納米顆粒中使用的可電離脂質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵特征是，通過(guò)TNS染料結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定，LNP中可電離脂質(zhì)的pKa應(yīng)在6-7范圍內(nèi)。理論上計(jì)算的大多數(shù)可電離基團(tuán)的pKa在8-9.5范圍內(nèi)，如下所示在氮原子上，使用商業(yè)軟件理論上估計(jì)水介質(zhì)中的這些值。pKa從理論值下降2-3個(gè)點(diǎn)至TNS值是由于脂相中質(zhì)子的溶劑化能量更高，導(dǎo)致脂相中的pH值比水相高2-3個(gè)點(diǎn)，在TNS測(cè)定期間測(cè)量pH值[102]。

由于siRNA產(chǎn)品需要重復(fù)給藥治療慢性疾病，人們擔(dān)心MC3中二亞油酸烷基尾的緩慢降解會(huì)導(dǎo)致重復(fù)給藥的蓄積和潛在毒性。MC3的生物可降解版本脂質(zhì)319（表2）是通過(guò)用在體內(nèi)易于被酯酶降解的伯酯取代每個(gè)烷基鏈中兩個(gè)雙鍵中的一個(gè)而產(chǎn)生的[68]。觀察到脂質(zhì)319在肝臟中的半衰期小于1小時(shí)，而其在肝臟中保持與MC3相似的基因沉默效率。在體內(nèi)證實(shí)了降解產(chǎn)物，以及其分泌和脂質(zhì)319的無(wú)毒性質(zhì)。在SARS-CoV-2的臨床前和臨床研究中引用了脂質(zhì)319的研究，作為BioNTech[49]和CureVac[53,69]產(chǎn)品中使用的Acuitas LNP類(lèi)別，盡管在倫敦帝國(guó)理工學(xué)院試驗(yàn)[60]中Acuitas LNP遞送的自擴(kuò)增RNA被引用為包含在最近的專(zhuān)利申請(qǐng)中[59]，這里由Acuitas的Lipid A9代表（表2）。最近，BioNTech批準(zhǔn)的BNT162b2中Acuitas可電離脂質(zhì)的同一性被披露為ALC-0315[40]（表2）。這些LNPs的一個(gè)重要方面是，它們是通過(guò)篩選IV給藥后肝臟中的mRNA表達(dá)而開(kāi)發(fā)的，可能還沒(méi)有完全優(yōu)化用于基于mRNA的疫苗的肌內(nèi)給藥。

Moderna最近開(kāi)發(fā)了一類(lèi)新的可電離脂質(zhì)來(lái)替代MC3，主要是由于上述與MC3降解緩慢相關(guān)的問(wèn)題，但也努力通過(guò)實(shí)現(xiàn)比二亞油酸MC3烷基尾更大的分支來(lái)提高其效力[42,101]。這類(lèi)新脂質(zhì)具有乙醇胺可電離頭基，與含有一級(jí)降解酯（如Maier 2013）的單個(gè)飽和尾連接，并與第二個(gè)飽和尾連接，后者使用降解性較低的二級(jí)酯在7個(gè)碳原子后分支成兩個(gè)飽和C8尾，如脂質(zhì)5[101]（表2）。優(yōu)化用于肝臟IV給藥，發(fā)現(xiàn)相似的脂質(zhì)H[42]或SM-102是疫苗肌內(nèi)(IM)給藥的最佳選擇。分支增加是Acuitas追求的共同特征，因?yàn)長(zhǎng)ipid A9共有5個(gè)分支鏈[59]（表2），而Moderna LNPs有3個(gè)分支鏈。分支增加被認(rèn)為可產(chǎn)生具有更多錐形結(jié)構(gòu)的可電離脂質(zhì)，因此，當(dāng)與內(nèi)體中的陰離子磷脂配對(duì)時(shí)，將發(fā)生更大的膜破壞能力，遵循幾十年前概述的分子形狀假設(shè)[12,91]。當(dāng)IV給藥時(shí)，24h時(shí)在肝臟中檢測(cè)不到脂質(zhì)5，而MC3以其初始劑量的71%存在于肝臟中，驗(yàn)證Lipid 5的降解性。IV給藥后，Lipid 5在小鼠中熒光素酶表達(dá)的效力是MC3的3倍，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中hEPO的效力是MC3的5倍。這些效力的增加與胞內(nèi)體釋放增加一致，可能是由胞內(nèi)體釋放增加引起的，對(duì)于Lipid 5，細(xì)胞中高達(dá)15%的mRNA從胞內(nèi)體釋放，而MC3為2.5%，后者與之前使用siRNA測(cè)定的MC3的結(jié)果相似[106]。然而，在這些內(nèi)體釋放實(shí)驗(yàn)中，MC3的細(xì)胞攝取是Lipid 5的4倍，因此這兩種LNPs在細(xì)胞質(zhì)中釋放的mRNA的絕對(duì)量相似。在疫苗的肌內(nèi)給藥中檢查了相同的可電離脂質(zhì)庫(kù)，同樣發(fā)現(xiàn)可降解，并且由于伯酯而迅速消除，并且對(duì)于流感核苷修飾的mRNA%__，與MC3相比，在蛋白表達(dá)或免疫原性方面效價(jià)通常增加3-6倍。小鼠中%編碼的免疫原，盡管非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的免疫原性與5µg初免-加強(qiáng)免疫劑量下的MC3相同[42]。脂質(zhì)H或SM-102（表2）被確定為最佳候選藥物，在結(jié)構(gòu)上僅與通過(guò)伯酯的二碳置換確定為IV給藥最佳的脂質(zhì)5不同。脂質(zhì)5 LNP的pKa為6.56，而脂質(zhì)H LNP的pKa為6.68，表明IM與IV給藥相比，pKa略微增加可能有益，盡管該差異在試驗(yàn)的變異性范圍內(nèi)。大鼠肌肉注射部位的組織學(xué)檢查表明，與MC3相比，Lipid HLNPs吸引的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞富集的炎性浸潤(rùn)較少，這可能會(huì)降低人體試驗(yàn)中注射部位的反應(yīng)原性[42]。

目前SARS-CoV-2臨床試驗(yàn)中的mRNA脂質(zhì)納米顆粒

5.1.BioNTech/Pfizer

Acuitas ALC-0315（表2）結(jié)合DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)是BioNTech SARS-COV-2試驗(yàn)中的遞送系統(tǒng)[40]。CureVac和倫敦帝國(guó)理工學(xué)院也可能使用ALC-0315，或可能使用A9（表2）。

BioNTech開(kāi)始用4種mRNA編碼的免疫原開(kāi)發(fā)其SARS-CoV-2疫苗，其中2種是核苷修飾的，1種是未修飾的，1種是自我擴(kuò)增的。有兩種核苷修飾的mRNA的報(bào)道：BNT162b1是編碼刺突蛋白受體結(jié)合域的短的~1kb序列，通過(guò)foldon三聚體結(jié)構(gòu)域修飾，通過(guò)多價(jià)顯示增加免疫原性。較長(zhǎng)的4.3kb BNT162b2編碼一個(gè)二脯氨酸穩(wěn)定的全長(zhǎng)膜結(jié)合刺突蛋白。BNT162b2最近獲得了歐盟和美國(guó)的緊急批準(zhǔn)。

在一項(xiàng)臨床前研究中，小鼠單次給予0.2、1和5µg BNT162b2后，可檢測(cè)到結(jié)合抗體和中和滴度。從最低劑量到最高劑量增加一個(gè)數(shù)量級(jí)，在Th2細(xì)胞因子水平非常低的CD4 + 和CD8 + 脾細(xì)胞中引起強(qiáng)烈的抗原特異性Th1 IFNγ和IL-2應(yīng)答[49]。引流淋巴結(jié)中還含有大量生發(fā)中心B細(xì)胞以及CD4 + 和CD8 + 濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，這些細(xì)胞先前被確定為mRNA LNP疫苗中LNP單獨(dú)誘導(dǎo)的一部分[33]。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，30µg或100µg的初免-加強(qiáng)免疫劑量引起的結(jié)合抗體和中和滴度是人恢復(fù)期試驗(yàn)組的10倍以上，并且產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1偏倚T細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答被認(rèn)為對(duì)預(yù)防疫苗相關(guān)的增強(qiáng)呼吸道疾病很重要[107]。在有限數(shù)量(6)的攻毒恒河猴中，兩次100µg劑量在支氣管肺泡灌洗和鼻拭子中檢測(cè)不到病毒滴度。

較小mRNA編碼免疫原BNT162b1的1期臨床試驗(yàn)計(jì)劃在第1天和第21天給予10、30和100µg劑量。中等劑量30µg誘導(dǎo)的抗體結(jié)合和中和滴度分別是人恢復(fù)期組的30倍和3倍。由于首次給藥后存在重度注射部位疼痛，因此未給予100µg劑量進(jìn)行加強(qiáng)劑量。30µg加強(qiáng)劑量組100%的受試者報(bào)告了注射部位疼痛，但嚴(yán)重程度為輕度或中度。以30µg劑量第二次接種疫苗后，幾乎所有受試者均發(fā)生輕度或中度全身不良事件發(fā)熱、寒戰(zhàn)或疲乏。該試驗(yàn)還證明了外周血單核細(xì)胞對(duì)Th1偏倚T細(xì)胞的強(qiáng)烈應(yīng)答[50]。

一項(xiàng)2期試驗(yàn)在年輕（18-55歲）和年長(zhǎng)（65-85歲）受試者組中比較了BNT162b1和BNT162b2[51]。老年受試者的結(jié)合和中和抗體滴度略低，但仍超過(guò)恢復(fù)期組。與年輕受試者相比，老年受試者的不良反應(yīng)嚴(yán)重程度也降低。與BNT162b1相比，在BNT162b2中發(fā)現(xiàn)全身不良事件（發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲乏）的頻率顯著降低約兩倍。正是BNT162b2耐受性的增加推動(dòng)了其選擇進(jìn)入3期試驗(yàn)，最近宣布了94%的有效性，因?yàn)樵诎参縿┙M中發(fā)生了162例COVID-19病例，而在接受兩次30µg BNT162b2給藥的疫苗接種組中僅發(fā)現(xiàn)了8例病例[3]

5.2. Moderna

在Moderna的研究中，核苷修飾的mRNA編碼免疫原是一種跨膜錨定的二脯氨酸穩(wěn)定的融合前刺突，具有天然的furin裂解位點(diǎn)，并在原型MC3 LNP基礎(chǔ)上的LNP中遞送，只是用Lipid H(SM-102)替代MC3[41,42]。該mRNA LNP(mRNA-1273)在第1天和第21天以1µg劑量注射時(shí)在幾種小鼠種屬中誘導(dǎo)中和抗體，但在0.1µg劑量時(shí)未誘導(dǎo)中和抗體[44]。T細(xì)胞應(yīng)答似乎是平衡的Th1/Th2應(yīng)答，在小鼠適應(yīng)的病毒攻毒模型中，小鼠肺和鼻甲中的病毒滴度在2次劑量1µg給藥后降低至基線，但在0.1µg給藥后未降低。在恒河猴中，2劑100µg劑量在外周血中產(chǎn)生高結(jié)合和中和滴度以及Th1偏倚反應(yīng)，也涉及強(qiáng)烈的Tfh反應(yīng)[45]。兩個(gè)10µg劑量組的滴度和T細(xì)胞應(yīng)答顯著降低。同樣，100µg劑量能夠?qū)⒅夤芊闻莨嘞匆汉捅鞘米又械牟《镜味冉档椭粱€，而10µg僅在肺部降低。

在1期研究中，每組15例患者接受2劑25、100或250µg，間隔4周，結(jié)合和中和滴度比100µg劑量的恢復(fù)期高約10倍，約相當(dāng)于25µg的恢復(fù)期[46]。100µg和250µg劑量組所有受試者均報(bào)告征集性不良事件，250µg組14例受試者中的3例報(bào)告重度不良事件并停藥。在隨后的老年患者（56-71歲和71歲以上）1期研究中，發(fā)現(xiàn)25µg和100µg劑量產(chǎn)生的結(jié)合抗體滴度高于恢復(fù)期血漿，而100µg劑量的中和滴度相當(dāng)，但低于25µg劑量的恢復(fù)期[43]。大多數(shù)患者（約80%）在第二次接種疫苗后仍發(fā)生不良事件，即使是在老年組。外周血分析顯示CD4 T細(xì)胞應(yīng)答存在Th1偏倚。與25µg劑量相比，100µg劑量的中和滴度更高，因此選擇該劑量用于3期試驗(yàn)，中期結(jié)果顯示90例COVID-19病例在安慰劑組與5例在疫苗接種組具有94.5%的有效性[2]。一個(gè)獨(dú)立的委員會(huì)對(duì)Moderna的3期試驗(yàn)進(jìn)行了中期分析，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良事件包括9.7%的參與者出現(xiàn)疲勞，8.9%出現(xiàn)肌肉疼痛，5.2%出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛，4.5%出現(xiàn)頭痛，而在輝瑞/BioNTech的3期試驗(yàn)中，頻率較低的是疲勞為3.8%，頭痛為2%[108]。

5.3. CureVac

The CureVac mRNA LNP(CVnCoV)是一種非化學(xué)修飾的序列工程mRNA，編碼在Acuitas LNP中遞送的二脯氨酸穩(wěn)定的全長(zhǎng)S蛋白，可能使用可電離脂質(zhì)ALC-0315。在小鼠中使用2µg劑量時(shí)，檢查了兩次給藥之間的周數(shù)，范圍為1-4周，發(fā)現(xiàn)Balb/c小鼠中較長(zhǎng)的間隔產(chǎn)生了較高的滴度和T細(xì)胞應(yīng)答以及平衡的Th1/Th2應(yīng)答[53]。需要第二次給藥以產(chǎn)生中和抗體，0.25µg的兩次給藥不足以產(chǎn)生中和抗體。在敘利亞金黃地鼠中，兩次10µg劑量（而非2µg）能夠?qū)⒎危ǘ潜羌祝┲械牟《镜味冉档椭粱€。

在檢查2-12µg劑量的1期臨床試驗(yàn)中，僅在最高12µg劑量下發(fā)現(xiàn)達(dá)到恢復(fù)期血清水平的中和滴度，導(dǎo)致正在進(jìn)行的2期試驗(yàn)納入更高劑量16和20µg[52]。接受12µg劑量的所有患者在每次給藥后均發(fā)生全身不良事件，大多數(shù)為中度和重度，而 > 80%的患者在輕度和中度水平發(fā)生局部注射部位疼痛。

5.4. TranslateBio

Translate Bio使用非修飾的mRNA編碼雙突變形式的二脯氨酸穩(wěn)定的刺突蛋白，并通過(guò)被引用為基于可電離脂質(zhì)C12-200[109]的LNP進(jìn)行遞送，其可能是最近從ICE-[110]或基于半胱氨酸的[55]可電離脂質(zhì)家族合成的候選物。在Balb/c小鼠中，0.2–10µg范圍內(nèi)的兩次給藥導(dǎo)致結(jié)合和中和滴度遠(yuǎn)高于恢復(fù)期水平。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，15、45和135µg劑量產(chǎn)生的滴度均超過(guò)人恢復(fù)期組[56]。免疫應(yīng)答也存在Th1偏倚。

5.5. Arcturus

Arcturus使用自擴(kuò)增、全長(zhǎng)、未修飾的mRNA編碼融合前SARS-CoV-2全長(zhǎng)刺突蛋白，通過(guò)LNP進(jìn)行遞送，該LNP使用可電離脂質(zhì)與硫酯，通過(guò)兩個(gè)額外的酯基將含胺的頭基與脂質(zhì)尾部連接。該家族中兩種可能的可電離脂質(zhì)是脂質(zhì)10a（[111]的表4）或脂質(zhì)2,2(8,8)4 C CH3（[57]的第33頁(yè)）（表2）。后者有三個(gè)分支，類(lèi)似于Moderna Lipid H，但有一個(gè)可降解的硫酯與頭基連接。觀察到自身擴(kuò)增mRNA的特征，即IM給藥后1周以上，熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)維持在相當(dāng)恒定的水平，而常規(guī)mRNA表達(dá)迅速下降[58]。

單獨(dú)接種疫苗在C57BL/6小鼠中產(chǎn)生了令人驚訝地體重減輕和臨床評(píng)分增加。小鼠中僅需要2µg或10µg（而非0.2µg）單次給藥，即可在Th1偏倚應(yīng)答中達(dá)到高于100的中和滴度，并具有高水平的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在K18-hACE2致死小鼠激發(fā)模型中，2µg或10µg單次給藥也具有100%保護(hù)作用，100%存活，無(wú)體重減輕，肺和腦病毒滴度降低至基線水平。Arcturus已經(jīng)完成了1期臨床試驗(yàn)，劑量為1-10µg，并選擇7.5µg進(jìn)行3期試驗(yàn)[112]。

5.6.帝國(guó)理工學(xué)院

倫敦帝國(guó)理工學(xué)院使用Acuitas LNP遞送的自擴(kuò)增mRNA編碼的融合前穩(wěn)定的刺突蛋白，該LNP在Lipid A9[60]代表的專(zhuān)利[59]中進(jìn)行了描述（表2）。在Balb/c小鼠兩次注射0.01µg至10µg劑量范圍后，獲得了較高的劑量依賴(lài)性抗體和中和滴度。該應(yīng)答存在強(qiáng)烈的Th1偏倚，與較低的0.1和0.01µg劑量相比，10和1µg劑量產(chǎn)生的抗原特異性脾細(xì)胞應(yīng)答高3倍。這種疫苗的1期臨床試驗(yàn)即將開(kāi)始。

5.7.朱拉隆功大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)

朱拉隆功大學(xué)與賓夕法尼亞大學(xué)合作，正在使用Genevant LNP（可能是CL1脂質(zhì)）開(kāi)發(fā)一種天然的加標(biāo)免疫原核苷修飾的mRNA LNP[61]。他們的目標(biāo)是在2021年第1季度開(kāi)始1期臨床試驗(yàn)，并在2021年第4季度開(kāi)始將疫苗分發(fā)給泰國(guó)和7個(gè)周?chē)牡椭林械仁杖雵?guó)家。

5.8. Providence Therapeutics

Providence Therapeutics被授予加拿大衛(wèi)生部許可進(jìn)行PTX-COVID-19B mRNA LNP疫苗人體臨床試驗(yàn)的通知[113]。C57BL6小鼠按照初免-加強(qiáng)免疫方案接受20µg劑量給藥后，對(duì)編碼受體結(jié)合域（furin裂解位點(diǎn)有或無(wú)突變的全長(zhǎng)加標(biāo)物）的三種mRNA候選物進(jìn)行臨床前研究[114]。來(lái)自Genevant未披露脂質(zhì)的臨床前數(shù)據(jù)結(jié)果（可能與表2中的CL1相似）顯示出對(duì)于全長(zhǎng)和furin突變有效負(fù)載的穩(wěn)健中和滴度，與[115]中觀察到的數(shù)據(jù)相似。1期臨床試驗(yàn)計(jì)劃于2021年第一季度開(kāi)始，疫苗的生產(chǎn)和分銷(xiāo)——等待監(jiān)管批準(zhǔn)——在同年進(jìn)行。

5.9.儲(chǔ)存和分銷(xiāo)

大多數(shù)在實(shí)驗(yàn)室中制造的RNA LNPs在4 °C下可穩(wěn)定數(shù)天，但隨后表現(xiàn)出體積增大和生物活性逐漸喪失，如熒光素酶表達(dá)[116]。在之前的siRNA LNP制劑中，通常觀察到LNP聚集的大小隨時(shí)間增加[117]。為了穩(wěn)定用于儲(chǔ)存和分銷(xiāo)的mRNA LNP疫苗，迄今為止需要冷凍形式。Moderna COVID-19疫苗需要在-25 ℃～-15 ℃保存，但在2 ℃～8 ℃之間也可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)30天，在8 ℃～25 ℃之間可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)12 h[118]。輝瑞/BioNTech COVID-19疫苗需要在-80 ℃至-60 ℃下儲(chǔ)存，然后解凍并在2 ℃至8 ℃下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)5天，然后在注射前用生理鹽水稀釋[119]。

與Moderna疫苗所需的常規(guī)冷凍溫度相比，輝瑞疫苗在分銷(xiāo)和儲(chǔ)存期間所需的干冰溫度更難達(dá)到。這些溫差背后的原因并不明顯，因?yàn)閮煞N疫苗均含有相似的高濃度蔗糖作為冷凍保護(hù)劑。Moderna mRNA LNPs在Tris和醋酸鹽兩種緩沖液中冷凍[41]，而Pfizer/BioNTech疫苗僅使用磷酸鹽緩沖液[40]。已知磷酸鹽緩沖液對(duì)冷凍不理想，因?yàn)槠湟子诔恋?，并在冰結(jié)晶開(kāi)始時(shí)引起pH值突然變化[120,121]。凍干對(duì)于mRNA LNPs一直具有挑戰(zhàn)性[116]。然而，Arcturus表示，他們的COVID-19 mRNA疫苗在凍干形式下是穩(wěn)定的，這大概會(huì)大大簡(jiǎn)化分布，盡管這種凍干制劑的溫度穩(wěn)定性尚未披露[122]。

原文來(lái)源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.01941