核酸脂質(zhì)體納米粒LNP介紹及其制備方法

1. 什么是核酸脂質(zhì)體納米粒LNP

脂質(zhì)體（Liposome）最早在1961年由科學(xué)家Alec Douglas. Bangham 和 R. W. Horne在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)分子組成的囊泡結(jié)構(gòu)，其脂質(zhì)雙分子層形成疏水外殼和內(nèi)部的水相空腔，兼具親水和疏水特性。脂質(zhì)納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是使用脂質(zhì)形成納米微粒的一種。在過去，科研人員通常使用脂質(zhì)納米粒直接包裹化學(xué)藥物，在基因治療領(lǐng)域，研究人員開始使用脂質(zhì)納米粒包裹核酸，如mRNA、siRNA、pDNA等，稱為核酸脂質(zhì)納米粒。

針對(duì)Covid-19新型冠狀病毒的mRNA疫苗開發(fā)，從病毒序列到成功上市只用了短短一年不到的時(shí)間。這在從前是無法想象和實(shí)現(xiàn)的。在這次針對(duì)Covid-19新型冠狀病毒的mRNA疫苗上，莫德納(Moderna)采用了自主開發(fā)的可電離脂質(zhì)SM-102，而輝瑞和BioNTech則從Acuitas公司獲得了一種名為ALC-0315的可電離脂質(zhì)的許可。

mRNA分子由于疫苗的關(guān)系為大眾所認(rèn)識(shí)，但是很多人卻不知道m(xù)RNA疫苗的幕后功臣，甚至可以說是整個(gè)機(jī)理的關(guān)鍵所在，是將mRNA封裝并且安全有效地送進(jìn)機(jī)體細(xì)胞的脂質(zhì)納米粒（Lipid Nanoparticle，LNP）。從技術(shù)上來講，核酸藥物的研發(fā)主要有三個(gè)壁壘：第一個(gè)是原料端，包括mRNA原料序列的篩選和修飾；第二個(gè)是遞送系統(tǒng)；第三個(gè)是整個(gè)藥物的生產(chǎn)工藝。目前采用微流控技術(shù)產(chǎn)生脂質(zhì)納米顆粒（LNP）， 將mRNA包裹在LNP 納米顆粒中，再進(jìn)入人體, 是FDA唯一批準(zhǔn)上市的mRNA傳遞技術(shù)，并且已經(jīng)在世界各地注射上億劑的mRNA新冠疫苗中采用，其技術(shù)的安全性和有效性已經(jīng)在這次全球的新冠疫情中得到驗(yàn)證。

 

2. 核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的作用機(jī)理

在包裹核酸的脂質(zhì)納米粒配方中，起關(guān)鍵作用的是可電離脂質(zhì)。例如Onpattro中的Dlin-MC3-DMA（簡(jiǎn)稱MC3），其pKa值在6.3-6.5 之間，這個(gè)特性讓它在血清的環(huán)境中表面電荷基本為中性，有利于細(xì)胞將帶有核酸片段的脂質(zhì)納米粒整個(gè)吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，形成胞內(nèi)體（endosome）。 一旦進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)體的酸性環(huán)境使電離脂質(zhì)的頭部質(zhì)子化并帶正電荷，從而與胞內(nèi)體的內(nèi)膜融合，釋放目標(biāo)核酸到細(xì)胞中發(fā)揮作用。

 

圖1 核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的作用機(jī)理

 

3. 核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備方法

最適合的技術(shù)還是采用微流控混合技術(shù)來制備核酸脂質(zhì)納米粒，該方法相對(duì)簡(jiǎn)便快速，條件溫和，同時(shí)容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)放大。微流控技術(shù)基本原理：將脂質(zhì)與核酸分別溶解在水相和有機(jī)相后，將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，完成核酸脂質(zhì)納米顆粒的合成。 改變流體注入速度和比率，可以控制脂質(zhì)納米顆粒的粒徑大小。將各種脂質(zhì)溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水緩沖液中，將兩相快速混合。通過稀釋乙醇相，脂質(zhì)的溶解度降低，在混合溶液中逐漸析出凝固并形成脂質(zhì)納米粒，同時(shí)高效包載mRNA。再經(jīng)緩沖液膜包超濾或者透析除去殘留的乙醇，中和緩沖液的pH值。

 

4. 制備核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的微流控芯片結(jié)構(gòu)

利用微流控芯片技術(shù)制備核酸脂質(zhì)體納米粒LNP主要是實(shí)現(xiàn)充分的混合，常采用魚骨結(jié)構(gòu)。芯片中魚骨結(jié)構(gòu)區(qū)域使流經(jīng)的液體產(chǎn)生混沌流動(dòng)，大大提高了液體的混合效率，比傳統(tǒng)的攪拌混合均一性好，從而在芯片的出口處快速產(chǎn)生均勻的流體。其中的魚骨結(jié)構(gòu)可以是凸起（如圖2所示），也可以是凹陷（如圖3所示），制備效果跟體系有關(guān)，其粒徑大小主要跟流速比有關(guān)。

 

圖2 魚骨結(jié)構(gòu)凸起

圖3 魚骨結(jié)構(gòu)凹陷

 

目前高校研究所及部分公司客戶尚處在核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的配方開發(fā)階段，常選用帶魚骨結(jié)構(gòu)的PDMS芯片進(jìn)行研究，一方面是因?yàn)镻DMS材質(zhì)的芯片加工周期短，成本低，另一方面是因?yàn)镻DMS芯片的特性使得實(shí)驗(yàn)參數(shù)更易獲得。以下3款核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備微流控芯片是研究者經(jīng)常使用的。

 

圖4 ZX-LS-11核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備芯片（魚骨結(jié)構(gòu)凸起）

圖5 ZX-LS-31核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備芯片（魚骨結(jié)構(gòu)凹陷）

圖6 ZX-LS-31P核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備芯片（魚骨結(jié)構(gòu)凹陷）

圖7 魚骨結(jié)構(gòu)核酸脂質(zhì)體納米粒LNP制備芯片實(shí)物圖（PDMS微流控芯片）

 

5. 制備核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的進(jìn)樣設(shè)備

中芯啟恒恒壓泵（壓力驅(qū)動(dòng)微流體進(jìn)樣儀）用于生成穩(wěn)定無脈沖的液流，其響應(yīng)時(shí)間短，適用于各種要求苛刻的微流體應(yīng)用。壓力控制器由計(jì)算機(jī)通過 USB 接口控制，使用中芯啟恒 FluidicLab Suite 軟件，可以生成復(fù)雜的壓力或流速曲線 ( 如正弦波，方波，三角波等 )。配套的中芯啟恒FluidicLab Suite 軟件可記錄并輸出壓力控制器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。

 

圖8 中芯啟恒恒壓泵連接示意圖

 

將壓力控制器 1 通道與 4 mm PU 管一端連接，然后把連接儲(chǔ)液池的 PTFE 管與流量傳感器的“in”接口相連，流量傳感器的另一端“out”連接 PTFE 管作為液體輸出口，最終組裝出設(shè)備如圖1所示。其余3個(gè)通道的連接與之相同。進(jìn)樣原理是：以氣推液，氣體管在儲(chǔ)液池頁面以上，出液管在儲(chǔ)液池液面以下，氣體擠壓液面，將液體從出液管擠出，實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣操作。

 

5.1 恒壓泵（壓力驅(qū)動(dòng)微流體進(jìn)樣儀）特點(diǎn)：

壓力輸出波動(dòng)小于 0.02% ，響應(yīng)時(shí)間 9 ms，無論恒流輸出還是變流 速輸出，均可應(yīng)對(duì)自如。
卓越的性能：
1）內(nèi)置壓力傳感器，高速 PID 控制，壓力輸出波動(dòng)：< 0.02%
2） 響應(yīng)時(shí)間：< 9 ms
3）可安裝四個(gè)獨(dú)立的壓力輸出通道 多種壓力輸出范圍（0-0.2 bar，0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar)，并可根據(jù)客 戶要求定制
4）可設(shè)置恒流輸出（需接流量傳感器）和壓力波形輸出

 

5.2 壓力控制器軟件的使用：

圖9中芯啟恒恒壓泵壓力控制窗口

 

如圖9所示，可以直接設(shè)置各通道的壓力參數(shù)，每個(gè)通道的壓力參數(shù)可以設(shè)置不同。

 

圖10中芯啟恒恒壓泵壓力控制設(shè)置窗口

 

如圖10所示，用戶可以設(shè)置實(shí)時(shí)壓力的讀取間隔，其最低設(shè)定值為 0.001s ( 實(shí)測(cè)讀取時(shí)最短讀取周期約為 0.02 s，低于此間隔的數(shù)據(jù)是重復(fù)的 )。備注信息，壓力校準(zhǔn)和同步增減系數(shù)設(shè)置（多路壓力協(xié)同輸出）也可以在此操作。

 

6. 制備的核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的粒徑范圍

如圖11所示，利用帶魚骨結(jié)構(gòu)的微流控芯片制備的核酸脂質(zhì)體納米粒LNP平均粒徑在142nm左右。

圖11 制備的核酸脂質(zhì)體納米粒LNP的粒徑范圍